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DEGRADATION & MECHANISM

靶蛋白降解
验证与机制研究

在内源或标签蛋白上用多种读出确认降解，并验证泛素化与蛋白酶体/E3 依赖性，给你一条可解释的机制证据链——用于验证 HiBiT 筛出的 hit，或不便自建 KI 系的项目。

01

三组实验，从读出到机制

按子领域分组，每一项都对应可执行的读出方法与它要回答的问题，按项目需要组合。

降解验证读出

多读出确认降解

在内源与标签蛋白上，用多种正交方法确认靶蛋白真的被降解。

  • Western Blot — 经典凝胶免疫印迹，确认靶蛋白条带丰度下降
  • Simple Western/Jess 定量 — 毛细管自动化印迹，给出更可比的定量信号
  • ICW（In-Cell Western） — 细胞原位免疫定量，适合中通量剂量/时间扫描
  • IFA/IF — 免疫荧光，看靶蛋白丰度与亚细胞定位变化
  • ELISA/AlphaLISA/HTRF 总蛋白 — 均相或板式定量靶蛋白总量
  • MSD 多因子 — 电化学发光多指标，一孔同读多个蛋白
  • Flow cytometry — 流式单细胞水平定量靶蛋白表达分布
  • HCA 高内涵成像 — 成像批量读出丰度与定位，兼看细胞状态
  • 内源蛋白与外源标签蛋白 — 两套体系并行，排除标签或表达干扰造成的假象
  • Dose-response 与 Time-course — 剂量与时间双维度，给出 DC50/Dmax 与降解动力学
泛素化与蛋白酶体依赖性

确认走泛素-蛋白酶体通路

验证靶蛋白确实被泛素化，且降解依赖蛋白酶体而非其它途径。

  • 靶蛋白泛素化检测 — 在细胞内确认 POI 上是否累积泛素信号
  • 体外泛素化 / 重组体系验证 — 视 E3、底物与复合物条件评估是否建立，重建泛素化反应验证靶蛋白可被直接修饰
  • IP-WB 检测 ubiquitinated POI — 免疫沉淀富集后印迹，看泛素化的靶蛋白
  • 泛素链型分析 — 重点关注 K48 等降解相关链型，并与 K63 等非典型 / 信号相关链型区分
  • MG132/Bortezomib rescue — 蛋白酶体抑制剂回补降解，证明蛋白酶体依赖
  • MLN4924/NAE 抑制剂 rescue — 抑制 neddylation，验证 CRL/E3 通路依赖
  • 蛋白酶体依赖 vs 溶酶体/自噬区分 — 配合溶酶体/自噬抑制剂，确认降解走的是哪条路
E3 依赖性与周转

锁定 E3 并量化周转

确定降解所依赖的 E3 与通路，并量化降解前后的蛋白周转变化。

  • E3 依赖性验证 — CRBN、VHL、DCAF15 等底物受体 / 适配蛋白依赖（敲低 / 敲除或配体竞争），及 DDB1 / CUL4 / CRL 通路依赖确认
  • E1/E2/E3 通路依赖性 — 沿酶联级联逐级验证降解的通路归属
  • CHX chase 蛋白周转 — 翻译阻断下追踪靶蛋白周转速率
  • 降解前后半衰期变化 — 对比给药前后靶蛋白半衰期，量化降解效应
02

你需要提供

我们从化合物与靶点信息开始；材料越完整，机制验证越准，缺少的部分会先做一次可行性沟通再定范围。

  • 化合物与浓度 — 待验证分子（结构式 / SMILES），以及建议的浓度梯度或起始剂量。
  • 靶点与细胞背景 — 靶点名称、亚型、物种来源，以及你关心的细胞体系或表达背景。
  • 已有体系与数据 — 若有标签蛋白 / KI 体系、抗体或既往降解数据，一并提供以便对齐对照。
  • 验证目标 — 你想确认哪一层——只是确认是真降解，还是要做到泛素化、蛋白酶体与 E3 依赖性的机制闭环。
03

你会拿到

一份可复核的降解与机制数据包，而不只是一条曲线。

  • 多读出降解验证 — 内源与标签蛋白上的多读出结果，含 Dose-response 与 Time-course 及 DC50/Dmax。
  • 泛素化与蛋白酶体证据 — 泛素化检测与 IP-WB 结果，以及 MG132/MLN4924 rescue 给出的蛋白酶体/E3 依赖性证据链。
  • E3 依赖性与周转 — CRBN/VHL 等 E3 依赖性验证，以及 CHX chase 周转与降解前后半衰期变化的整合数据。
  • 边界说明 — 体内/动物药效、DMPK、IHC/病理、大规模质谱蛋白组学由具备资质的协作平台执行，我们负责方案设计、降解读出与数据整合。
04

常见问题

怎么区分是真降解，还是只是表达下调或检测假象？
我们在内源与外源标签蛋白上用多种正交读出交叉验证，并配合 Dose-response 与 Time-course 双维度；再用 MG132/MLN4924 rescue 与 CHX chase 判断是否为蛋白酶体依赖的主动降解，排除转录/表达下调与抗体假象。
没有敲入（KI）细胞系、只有内源蛋白，能做机制验证吗？
可以。本模块正适合不便自建 KI 体系的项目——直接在内源蛋白上用 WB、Simple Western/Jess、流式或高内涵成像确认降解，再补泛素化与 E3 依赖性验证，形成机制闭环。
怎么确认降解走的是泛素-蛋白酶体，而不是自噬/溶酶体？
通过靶蛋白泛素化检测与 IP-WB 看泛素信号，配合 MG132/Bortezomib（蛋白酶体）与 MLN4924（neddylation/CRL）rescue；必要时加溶酶体/自噬抑制剂对照，明确降解归属的通路。
能定位到具体依赖哪个 E3 吗？
可以做 CRBN、VHL、DCAF15 等底物受体的依赖性验证（敲低/敲除或配体竞争），并沿 DDB1/CUL4/CRL 通路逐级确认，给出降解所依赖的 E3 与通路判断。
机制验证需要多少化合物、什么信息才能启动？
提供待验证分子（结构式/SMILES）与建议浓度梯度、靶点与细胞背景即可；若已有标签体系、抗体或既往降解数据一并提供更好。材料不全时我们先做一次可行性沟通再定范围。

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把化合物与靶点信息发给我们，先聊清楚要验证到哪一层机制。

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